理化学研究所、薬の効果がもたらす遺伝子発現の変化を網羅的・定量的に捉えることに成功

薬の効果がもたらす遺伝子発現の変化を網羅的・定量的に捉える
－抗がん剤投与時のプロモーター活性の変化をゲノム全域で解析することに成功－

＜ポイント＞
　・理研独自の「非増幅deepCAGE法」で薬剤作用のプロモーター活性を測定
　・従来法では難しかった弱い薬剤作用を定量的に捉えることに成功
　・未解析薬剤の標的タンパク質や作用機序の解析などに広く応用が可能

＜要旨＞
　理化学研究所（理研、野依良治理事長）は、薬剤の作用を遺伝子発現量の変化（プロモーター活性［１］の変化）として網羅的・定量的に捉えることに初めて成功しました。これは、理研ライフサイエンス技術基盤研究センター（渡辺恭良センター長）機能性ゲノム解析部門（ピエロ　カルニンチ部門長）の鈴木治和グループディレクターらと、理研社会知創成事業予防医療・診断技術開発プログラム（林崎良英プログラムディレクター）の川路英哉コーディネーターらの共同研究グループによる成果です。

　新薬開発において創薬候補物質が標的細胞の遺伝子発現をどのように変化させるかを捉えることは、薬理作用を解明するうえで重要です。従来はこの目的のためにマイクロアレイ法［２］が広く用いられてきましたが、検出感度が低く、測定できる遺伝子の種類が限定されるなどの理由で、十分な定量解析が行えませんでした。

　理研が開発した独自技法「非増幅deepCAGE法［３］」は、細胞中のmRNAを少量でも偏りなく網羅的に捉え、遺伝子の転写開始点の直上流にあるプロモーター活性を測定できます。さらに、塩基配列を高速に解析できる次世代シーケンサーを用いることで、解析対象の細胞に存在する全mRNAの種類と量が解析可能となります。

　共同研究グループは、非増幅deepCAGE法を用いて、抗がん剤を投与する前と投与した後のがん細胞のプロモーター活性を解析しました。その結果、薬剤の作用により個々のプロモーター活性が促進あるいは抑制されたかを、定量的かつ感度良く捉え、２次元上のグラフ（プロモーター活性プロファイル）として示すことができました。また、標的分子が異なる２種類の抗がん剤によるプロモーター活性変動の相違は、２つのプロファイルの比較で明瞭に観察できました。さらに、２種類の抗がん剤のプロモーター活性プロファイルを組み合わることで、同じ情報伝達経路内の別の分子に作用するもう１種類の抗がん剤のプロモーター活性プロファイルを表せることも分かりました。これは、既知の薬剤のプロモーター活性プロファイルから、未知の薬剤の作用を推定することが可能であることを示します。

　これらの結果は、非増幅deepCAGE法を用いた遺伝子発現の定量解析が、既存の薬剤の標的タンパク質や作用機序の解明などに広く応用可能であり、新薬開発での薬理学分野への貢献が期待できることを示しています。本成果は、科学雑誌『CPT　Pharmacometrics　and　Systems　Pharmacology』（９月２５日付け：日本時間９月２６日）に掲載されました。

＜背景＞
　新薬の開発では、候補薬物の作用を細胞レベルでモニターし、それらの薬効や安全性を評価することが、基本的な作業となっています。特に、薬剤投与の前後で細胞に発現している遺伝子をゲノム全域にわたって捉え、薬剤の作用を遺伝子発現量の変化として定量的に捉える手法が注目されています。これまでは、マイクロアレイ法を用いた解析が盛んに行われてきました。マイクロアレイ法は、測定試料（細胞から抽出したRNAから合成したDNA）と、予めデザインされたDNAプローブとのハイブリダイゼーション［４］により遺伝子発現の有無やその発現量などの情報を検出しますが、測定するRNAの種類、測定感度、測定値の定量性の範囲などにおいて制約がありました。そのため、ゲノム全域において遺伝子発現変化の十分な定量的解析ができませんでした。

　CAGE（Cap　Analysis　of　Gene　Expression）法は、理研が開発した独自の技法です。この特徴は、mRNAの末端の塩基配列（CAGEタグ）を調べて１塩基の精度でゲノム上に存在する転写開始点［５］を網羅的に同定することにより、その直上流に存在するプロモーターを同定し、かつ、その位置からスタートする転写物の発現量（プロモーター活性）も測定できることです。CAGE法は、理研が主催する国際科学コンソーシアムFANTOM［６］でのゲノム全域な解析に用いられました。さらにFANTOMではCAGEの技術を次世代シーケンサーと組み合わせることでdeepCAGE法を開発し、血球系細胞の分化過程におけるプロモーターレベルでの転写制御ネットワーク解析に成功しました（注１））。また最近では、ヒトゲノムの全ての機能要素の解析を目指したENCODEプロジェクト［７］において、プロモーター活性を示す指標としてCAGEデータが使われました（注２））。

　これまで共同研究グループはCAGE法を用いて、ヒトやマウスの正常組織、培養細胞のプロモーター活性解析を行なってきましたが、薬剤作用に関する詳細なプロモーター活性解析は未着手でした。その理由として、〔１〕１００万個以上のCAGEタグが必要なこと、〔２〕シーケンス用サンプルを調製する際にPCRを用いるためわずかなプロモーター活性の変化を厳密に捉えるのが技術的に困難なこと、などが挙げられます。しかし、〔１〕については、次世代シーケンサーの登場により、deepCAGE法を用いて数１００万のCAGEタグを短時間、かつ低コストで得られるようになりました。また、〔２〕についても、PCRを用いない非増幅deepCAGEライブラリー調製法の開発に成功し、上記の制約はなくなりました。今回、共同研究グループは、薬剤作用がもたらす微弱な遺伝子発現の変化を網羅的・定量的に捉えるため、詳細なプロモーター活性解析に挑みました。

　注１）２００９年４月２０日プレスリリース　http://www.riken.jp/pr/press/2009/20090420/
　注２）２０１２年９月６日プレスリリース　http://www.riken.jp/pr/press/2012/20120906/

＜研究手法と成果＞
　本研究では、ヒト乳がん由来の細胞株であるMCF－７細胞をモデルとし、３種類の抗がん剤（U０１２６、ワルトマニン、ゲフィチニブ）をそれぞれ投与した時のがん細胞のプロモーター活性の変化を調べました。３つの薬剤は、がん細胞の増殖に関わる情報伝達経路の阻害剤です。U０１２６とワルトマニンは、それぞれRas－ERKおよびPI３K－Aktと呼ばれる情報伝達経路を阻害します。一方ゲフィチニブは、EGFRと呼ばれるレセプターキナーゼを標的として阻害しますが、その結果EGFR下流の主要な情報伝達経路であるRas－ERKおよびPI３K－Akt情報伝達経路も阻害します（図１）。各薬剤は、阻害効果が現れる濃度レベルで、できる限り低い濃度を用いました。

　非増幅deepCAGE法によるゲノム全域のプロモーター活性解析の結果、共同研究グループはMCF－７細胞から１万個あまりのプロモーターを同定することができました。これらのプロモーター活性を３回の独立した実験で測定しましたが、その結果実験間での再現性が極めて高いことが分かりました。そこで、薬剤を投与しなかった細胞と抗がん剤を投与した細胞を比較し、統計的に有意なプロモーター活性の変化が見られた遺伝子を同定しました。具体的には、U０１２６では１３９種、ワルトマニンでは１６８種、ゲフィチニブは１５７種のプロモーター活性に変化が見られました（図２左）。この中には、すでに論文報告されているErbB３などのがん遺伝子も含まれており、今回の実験結果が正しいことが示されました。

　次に、異なる情報伝達経路に標的分子を持つU０１２６とワルトマニンの薬剤作用の違いを、本技法で検出できるか検討しました。それぞれを投与した細胞のプロモーター活性の変動を比較解析したところ、阻害する情報伝達経路に応じたプロモーター活性変動の相違が明瞭に観察されました。一方、同じ試料をマイクロアレイ法で解析した結果では、この相違をうまく捉えることができませんでした（図２右）。

　さらに、ゲフィチニブ投与によるEGFRの阻害効果が、EGFRの下流に存在する２つの主要な情報伝達経路（Ras－ERK、PI３K－Akt）の阻害剤であるU０１２６とワルトマニンそれぞれの阻害効果で説明できるかを検討しました。その結果、ゲフィチニブ投与時の阻害プロファイルは、U０１２６とワルトマニンそれぞれの阻害プロファイルによって表せることが分かりました（図３）。

＜今後の期待＞
　次世代シーケンサーを利用した非増幅deepCAGE法により、薬剤作用をプロモーター活性プロファイルとして、初めて定量的かつ感度良く捉えることができました。このことは、新薬開発だけでなく、これまで未知であった既存薬剤の標的タンパク質や作用機序を解析するために、広く利用できることから、新薬開発への応用が期待できます。また、臨床現場における薬効配合剤や複数薬剤投与の評価への応用が可能であり、今後の薬理学に貢献するライフサイエンス技術として期待できます。

＜原論文情報＞
　・Kazuhiro　Kajiyama，Mariko　Okada－Hatakeyama，Yoshihide　Hayashizaki，Hideya　Kawaji，Harukazu　Suzuki．"Capturing　drug　responses　by　quantitative　promoter　activity　profiling．"CPT　Pharmacometrics　and　Systems　Pharmacology，２０１３，doi：１０．１０３８／psp．２０１３．５３

＜発表者＞
　独立行政法人理化学研究所
　ライフサイエンス技術基盤研究センター　http://www.riken.jp/research/labs/clst/
　機能性ゲノム解析部門　http://www.riken.jp/research/labs/clst/genom_tech/
　オミックス応用技術研究グループ　http://www.riken.jp/research/labs/clst/genom_tech/omics_app_tech/
　グループディレクター
　鈴木　治和（すずき　はるかず）

　独立行政法人理化学研究所
　社会知創成事業　http://www.riken.jp/research/labs/rci/
　予防医療・診断技術開発プログラム　http://www.riken.jp/research/labs/pmi/
　コーディネーター　川路　英哉（かわじ　ひでや）

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